X 注册生物链会员

扫描二维码关注生物链
中科大孙宝林课题组:III型-A CRISPR-Cas系统改造耐药金黄色葡萄球菌的基因组
来源:中科大   发布者:ailsa   日期:2017-12-05   今日/总浏览:3/709

CRISPR-Cas系统是古细菌及其他细菌的获得性免疫系统,是细菌为了抵御外源基因入侵而形成的自我保护机制。根据CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins ,cas)的结构和功能,将为CRISPR-Cas系统分为5个类型,其中I 型、 II型和III型CRISPR-Cas系统最近研究较多。已有研究表明III型CRISPR-Cas系统由9个cas蛋白(包括cas和csm)和间隔序列(spacer)组成,其中Cas10是参与crRNA的成熟和剪切入侵外源DNA的特征蛋白。孙宝林课题组在之前研究发现6株临床分离株(S. aureus AH1, AH2, AH3, SH1, SH2, 和SH3)含有III型-A CRISPR-Cas系统,且对系统中重复序列研究发现它们具有较高保守性。此外,与I 型和 II型 CRISPR-Cas 系统较大不同, III型CRISPR-Cas系统不需要PAM(protospacer adjacent motif)序列,但其crRNA 5’-tag序列(ACGAGAAC)发挥着同样的作用。孙宝林团队便利用其中一种社区获得性耐药金黄色葡萄球菌(S. aureus AH1)自身所具有III型-A CRISPR-Cas系统来设计实现对其基因组进行剪切。

孙宝林团队先通过截断CRISPR的先导序列(leader sequences)确定基因组中CRISPR的启动子区,再将此片段、保守的重复序列与靶向金黄色葡萄球菌mec基因盒的间隔序列组装成CRISPR质粒。再利用S. aureus AH1所具有的cas蛋白和体外设计的CRISPR质粒,对中基因组中mecA基因进行靶向剪切。研究者对间隔序列的长度和方向与靶向性的关系进行研究,表明间隔序列在33bp和36bp时靶向效率可达99%,并证明了III型-A CRISPR-Cas靶向编码序列。并对crRNA 5’-tag序列进行不同的突变,证明crRNA 5’-tag与原型间隔(protospacer)临近序列有三个连续的配对,将会大大的降低基因的靶向性,这也是含有III型CRISPR-Cas系统的细菌用来识别自己和外源序列,防止剪切自身序列的机制。此外,他们将存活的转化子进行分析,发现有87.5%是靶点被删除,10.2%是cas基因发生了突变,2.3%是CRISPR质粒中的间隔序列被删除(如图1)。

image.png

图1 存活转化子突变分析

研究者系统的研究了金黄色葡萄球菌的III型CRISPR-Cas系统在基因组靶向剪切中的CRISPR质粒各种参数,使得靶向效率提高。在对存活转化子分析中发现S. aureus AH1具有具有较大概率(87.5%)自我修复功能,且同时发生大片段的基因缺失,因此,用此方法用于耐药菌株中耐药基因或致病基因的敲除是大有希望的。

相关新闻