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CRISPR女神Nature发表高保真Cas9最新成果
来源:中国生物技术网   发布者:尹海华   日期:2017-10-23   今日/总浏览:1/4315

基于CRISPR-Cas9系统的基因组编辑工具近几年迅猛发展,来源于酿脓链球菌的SpCas9被广泛应用于定点编辑各种细胞、动物以及植物。然而,Cas9脱靶现象是目前限制其发挥巨大潜力的最主要问题之一,为此科学家设计出了SpCas9的一系列变体来克服脱靶效应。SpCas9-HF1和eSpcas9(1.1)这两种变体以前被报道在细胞中能大幅减少脱靶切割,但其靶向识别的机制以及潜在的提升SpCas9保真度的方法却一直未研究清楚。

10月19日,Nature杂志以Letter形式在线发表了CRISPR女神Jennifer A. Doudna的最新成果“增强校对控制CRISPR-Cas9的靶向精确性”。利用单分子荧光共振能量转移技术,作者发现了减少脱靶的SpCas9重要结构域REC3,并在此基础上设计出了高精确性的Cas9变体,称为“HypaCas9”,在细胞中证实其具有基因组范围高度特异性,且不降低靶向切割效率。

以前的研究显示,SpCas9-HF1和eSpCas9(1.1)在切割靶向DNA时效率与WT SpCas9相似,然而在切割有错配的DNA,即潜在脱靶位点时其切割活性显著下降。作者首先发现SpCas9-HF1和eSpCas9(1.1)与DNA结合的亲和力与WT SpCas9相比无显著区别,由此猜测其增强特异性可能是一种新的机制,而与亲和力无关系。


基于这种猜测,作者通过单分子荧光共振能量转移技术证实SpCas9靶向特异性是通过其HNH结构域的调控来实现的。随后又发现REC3域的5个Cluster在HNH结构域调控中发挥重要作用,并通过REC3删除等实验予以证实。

基于这些发现,作者在REC3域的这关键Cluster中设计了一系列突变,构建出了HypaCas9变体。并通过GUIDE-seq证明了HypaCas9具有高度特异性,比SpCas9-HF1和eSpCas9(1.1)脱靶效应更低。

Cas9的脱靶效应一直是限制其更广泛应用特别是用于基因治疗的主要障碍,Jennifer A. Doudna的这项HypaCas9成果极大增强了靶向特异性以及降低脱靶效率,必将极大的促进Cas9技术在基因编辑领域发挥更大的作用。


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