基于这种猜测,作者通过单分子荧光共振能量转移技术证实SpCas9靶向特异性是通过其HNH结构域的调控来实现的。随后又发现REC3域的5个Cluster在HNH结构域调控中发挥重要作用,并通过REC3删除等实验予以证实。
基于这些发现,作者在REC3域的这关键Cluster中设计了一系列突变,构建出了HypaCas9变体。并通过GUIDE-seq证明了HypaCas9具有高度特异性,比SpCas9-HF1和eSpCas9(1.1)脱靶效应更低。
Cas9的脱靶效应一直是限制其更广泛应用特别是用于基因治疗的主要障碍,Jennifer A. Doudna的这项HypaCas9成果极大增强了靶向特异性以及降低脱靶效率,必将极大的促进Cas9技术在基因编辑领域发挥更大的作用。