Cas12a的切割机制如图,首先Cas12a上的gRNA能识别靶DNA链上的PAM序列,如果它们正确地匹配,就会结合成一种RNA-DNA螺旋(R-环)结构。当完整的R-环形成时,Cas12a酶才结合和切割这条靶DNA。
研究人员发现,Cas12a基本上每个完全结合事件都会导致DNA的切割,因此可以确定必须通过结合动力学来决定Cas12a对错配的特异性。
为了检测Cas12a对gRNA和靶DNA之间错配的特异性,研究人员在R环的每个位置引入了DNA中的单碱基对变化(错配),测量了Cas12a从这些错误的DNA靶标的结合和解离速率。
结果表明,R环内除了一个错配之外的所有错配都增加了解离速率。有趣的是,解离率的最大增加是由PAM远端错配引起的,除了一个错配产生3倍(T14C)的较小增加,PAM-远端错配使解离速率增加6至80倍。相比之下,PAM-近端错配增加的Cas12a解离率仅达到5倍。
他们认为,Cas12a-gRNA与靶DNA结合时,Cas12a特异性在R-环形成期间确定,R环的形成具有晚期过渡态,并且它的形成是通过规定的途径,首先从PAM开始,并且在过渡态中,PAM-近端碱基对用于R-环形成的程度远大于PAM-远端碱基对。尽管整个结合过程具有不可逆转的性质,但这种晚期过渡态允许Cas12a区分错配,因此解离率增加。
这表明工程化核酸酶可以将过渡态进一步转移到R-环的PAM-远端区域,从而扩展基因编辑应用的区域和整体特异性水平。
动力学分析证明,Cas12a与靶DNA的结合涉及两个步骤(机制):
(1)初始步骤代表识别PAM序列,这是快速且可逆的;
(2)接下来,R-环以速率常数rv0.1s-1在PAM附近形成,随即快速扩大;完全形成R-环后,非靶标链(NTS)的裂解快速发生,靶标链(TS)的裂解发生缓慢10倍。
该团队目前正在一个后续项目中使用这些结果,旨在设计改进的Cas12a。
IlyaFinkelstein教授说:“总的来说,Cas12a更好,但是有些地方Cas12a仍然令人惊讶地对其RNA和基因组靶标之间的错误配对视而不见。因此,我们所做的工作是进一步改进Cas12a以建立一个防错的基因编辑系统。”
新型CRISPR酶助力基因编辑技术
去年,张锋研究团队测试了来自15种不同微生物的Cas13a(C2c2酶),最终发现LwaCas13a可比以前的RNA敲低工具(RNAi)更强的特异性在靶RNA上切割特定位点,脱靶效应低。另外,他们还找到了Cas13的“死亡变体”,结合RNA却不能进行切割作用,并且可通过结合荧光标记来追踪RNA的轨迹。
《Mol Cell》上的一项研究发现,Cas13b像Cas13a一样,仅需要单个向导RNA就能找到靶标,并且从遗传学的角度是可编码的。此外,Cas13b能够同时靶向多个RNA转录本。但Cas13b的一些特性表明其更适用于微调基因功能。
今年2月,Broad研究所的大牛David Liu通过加速Cas9酶在实验室中的演化,并不断累积Cas9的特定突变,带来了全新的进化版Cas酶——xCas9,比起目前使用最广泛的spCas9,xCas9在转录激活、DNA剪切、单碱基编辑等方面的应用范围扩大了四倍。同时,xCas9的脱靶效应比spCas9低得多,部分序列的试验数据仅有原始版的1/100。
3月,Salk研究所的Patrick D. Hsu博士带领团队,开发出了一种新的靶向RNA的基因魔剪——CasRx,这是一种来自肠道细菌Ruminococcus flavefaciensXPD3002的Cas13d酶。与靶向RNA的其他技术相比,CasRx是独特的,因为它尺寸小、有效性高,且与RNA干扰相比,没有产生明显的脱靶效应。
结语
CRISPR基因编辑技术给许多遗传疾病和罕见病带来了希望,CRISPR系统的进一步完善,安全性的逐步提高是未来必然的方向。Cas9是CRISPR中最常用的酶,这次研究或许能促进对CRISPR使用的酶的机制的阐明以及酶工程的改造。CRISPR技术还有待深入开发,不管是版本还是使用途径,期待未来科学家能运用得如鱼得水,创造更多的可能。