近日，天工所孙周通/Manfred T.Reetz团队与上海有机所周佳海团队、瑞士联邦理工学院袁曙光博士合作在JACS发文解析了柠檬烯环氧化物水解酶突变体的底物催化特异性与立体选择性催化机制。

图1 LEH中两种不同的亲核攻击方式

经定向进化的柠檬烯环氧化物水解酶（limonene epoxide hydrolase，LEH），能够选择性催化环戊烯氧化物或环己烯氧化物，使它们发生不对称水解反应，分别产生(R, R)-和(S，S)-构型的手性二醇。研究人员利用定向进化技术，结合突变体晶体结构分析和理论计算，解析了这种水解酶突变体的底物选择的特异性与立体选择性不对称催化机制。

作者发现，在定向进化过程中，针对环己烯氧化物筛选出来的突变体，丧失了对环戊烯氧化物的催化能力，而有些突变体保留了对两者的同时催化性能。通过突变体晶体结构与底物复合体解析，发现在对环戊烯氧化物丧失催化能力的突变体的底物结合口袋中，环戊烯氧化物存在多重构象，不利于催化的发生，MD计算分析发现底物的结合口袋体积发生明显变化，进一步支持了这一结论。一个相对紧凑的结合口袋可以稳定较小的底物和较大的底物，相比之下，更松弛的结合口袋不利于较小底物形成有利的亲和攻击构象，从而导致LEH突变体无法催化较小的底物，而在环氧环己烯的立体反应中，反应构象很容易便能形成。

研究者利用立体探针的概念，结合量子力学（QM）和分子动力学（MD）的计算手段进一步阐释了突变体的立体选择性催化机制，当底物接近LEH时，可诱发H4、C环、环A发生构象变化，使底物结合口袋打开，有利于底物进入催化活性中心形成特定几何构型，降低催化能垒。随后，一个已经活化的高度保守的水分子，即与Y53、 N55、D132以氢键结合，通过两种不同的方式进行亲核攻击：要么攻击环氧基的C1基团，要么攻击C2基团（如图1)。如果水分子距离C1 (d1)基团更近，就有利于(R，R)-构型的手性二醇形成，相反则形成（S,S）-构型的产物。

研究还通过交互指纹（interaction fingerprint，IFP）分析了突变体结合口袋关键氨基酸残基与底物的相互作用强度，它们在维持特定底物构象的形成方面起到至关重要的作用，从而使底物构象与特定的产物相对应。

定向进化技术与X-射线晶体结构解析以及理论计算的组合使用是该文的亮点之一，可以深度解析酶催化底物结合口袋重塑和特异底物的选择催化与立体选择性催化机制，为蛋白质工程用于理性设计新酶与新反应提供了理论基础。