利用CRISPR/Cas9技术通过碱基替换策略获得草甘膦抗性的水稻材料

CRISPR/Cas9技术在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命，该技术已经广泛应用于包括农作物在内的各种生物体的基因组编辑。科学工作者利用该技术，创造了大量的植物内源基因功能缺失的突变体，为植物的功能基因组学研究和应用研究做出了巨大的贡献。然而对植物内源基因进行更为精确地修饰，如基因定点替换以及基因的定点插入等，仍然具有极大的挑战性，这严重限制了CRISPR/Cas9技术在植物基因组学研究和农作物分子设计育种中的应用。

水稻（Oryza sativa）是世界上最重要的三大粮食作物之一，是全球一半以上人口赖以生存的基本食粮。防治杂草是水稻生产的主要问题之一，更是旱稻生产的关键。未进行杂草防治的水稻田一般减产5-15%，严重的减产15-30%。农民需要喷洒大量除草剂来防除杂草。草甘膦是目前世界上使用量最大的除草剂，因此研制草甘膦抗性的农作物新品种是国内外种子公司和科研单位的研究热点。目前生产上推广的抗草甘膦作物，几乎全部为通过导入农杆菌属的CP4菌株的EPSPS基因获得的，这些农作物携带有外源基因，在转基因育种的生物安全问题备受关注的情况下，转基因品种的商业化受到极大的阻碍，因此通过编辑水稻的内源基因，获得抗草甘膦的水稻具有重要意义。

中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组和李家洋研究组合作利用在修复途径中占主导地位的非同源末端连接（NHEJ）修复方式在水稻中建立了基于CRISPR/Cas9技术的基因替换以及基因定点插入体系。该研究通过在水稻5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因（OsEPSPS)）的第一内含子和第二内含子中分别设计一个有活性的靶位点并将两个靶位点构建到一个敲除载体中，同时构建了含有碱基定点替换（C518-T、C529-T和A531-G ）的片段作为供体载体，且替换片段两端含有与敲除载体中相同的靶位点；利用基因枪法将敲除载体与供体载体共同转化水稻愈伤组织，由于水稻基因组和供体载体中都含有上述靶位点，敲除载体在基因组上切割产生两个DNA双链断裂、同时切割供体载体产生含有碱基定点替换的DNA片段；利用NHEJ修复方式，含有碱基定点替换的DNA片段替换原来基因组中位于两个靶位点之间的DNA片段，在水稻基因组中实现了基因的定点替换，基因定点替换的效率为2.0%；类似的，在水稻基因组中实现了基因的定点插入，基因定点插入的效率为2.2%。利用建立的基因定点替换和定点插入两种策略，实现了水稻内源OsEPSPS基因保守区两个氨基酸的定点替换（T102I和P106S, TIPS），在T0代获得了TIPS定点替换的杂合体，对草甘膦具有抗性。传代分析结果表明EPSPS基因TIPS突变稳定遗传到下一代。该研究利用修复途径中占主导地位的NHEJ修复方式，在植物中建立的基因定点替换及定点插入策略具有简单、高效以及广适性的优点，大大拓展了CRISPR/Cas9技术在植物中的应用，为植物基因功能的解析和农作物分子设计育种提供了一个全新的技术路线。

该项研究成果于9月12日在线发表于《自然-植物》（Nature Plants DOI:10.1038/nplants.2016.139）。高彩霞研究组的博士研究生李君和李家洋研究组的助理研究员孟祥兵为该论文的共同第一作者，高彩霞与李家洋为共同通讯作者。该项目得到科技部、国家农业部和国家自然科学基金等项目的资助。